蛋白纯化系统中亲和纯化常见问题及解决方法-上海金鹏

感谢使用上海金鹏蛋白纯化系统Blupadstart进行蛋白纯化分离实验。
1. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?
出现这样的情况，主要是缓冲液中 DTT 的影响， DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 DTT 还原生成
棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与（一般的镍柱耐受小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要**过2mM DTT）。
2. 通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？
（1）如果蛋白纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶控制剂改进。
（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
3. 镍柱堵了怎么办？
（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。
（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行)，还不行加尿素变性，使其在变形环境下。
（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在1/10-1/15 之间较适宜。
4. 纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？
（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。
（2）加入肌氨酸钠，*使蛋白变性，消除浑浊现象。

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